广西壮族人群8q24.21区域单核苷酸多态性与腰椎退行性疾病的相关性：800例资料分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1243

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (19): 2980-2985.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1243

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广西壮族人群8q24.21区域单核苷酸多态性与腰椎退行性疾病的相关性：800例资料分析

刘洋，杨庆华，关业文，王嘉琦，江华

(广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021)

收稿日期:2019-02-19 出版日期:2019-07-08 发布日期:2019-07-08
通讯作者: 江华，博士，副主任医师，硕士生导师，广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:刘洋，男，1987年生，四川省蓬溪县人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81460353，81860406)，项目负责人：江华；广西自然科学基金(2015GXNSFBA139167)，项目负责人：江华

Association between single nucleotide polymorphism (8q24.21) and lumbar degeneration disease in 800 cases from Guangxi Zhuang Autonomous Region

Liu Yang, Yang Qinghua, Guan Yewen, Wang Jiaqi, Jiang Hua

(Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Received:2019-02-19 Online:2019-07-08 Published:2019-07-08
Contact: Jiang Hua, MD, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Liu Yang, Master candidate, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460353 and 81860406 (both to JH); the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2015GXNSFBA139167 (to JH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
单核苷酸多态性：指由于单个核苷酸碱基改变而导致核酸序列的多态性。不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象。人群中任意2个不相关的个体DNA序列有99.8%是相同的，而余下的0.2%包含了遗传上的差异因素，造成了不同的生理表型，罹患疾病的风险等。
全基因组关联分析：指人类全基因组范围内找出存在的序列变异，即从中筛选出与疾病相关的单核苷酸多态性位点。在很多捕获了整个基因组的大部分遗传信息单核苷酸多态性中，检测与疾病或者性状的联系的单核苷酸多态性位点，全基因组关联分析可以识别与疾病和性状风险直接或者间接相关的变异。

摘要
背景：基于北欧人群的全基因组关联分析研究发现8q24.21区域的单核苷酸多态性与腰椎间盘突出存在相关性，但由于存在种族差异性，其研究结果在其他人群尚未验证。
目的：探讨在广西壮族人群中8q24.21区域单核苷酸多态性与腰椎退行性疾病是否存在相关性。
方法：病例组为2015年1月至2016年12月住院治疗的腰椎退行性疾病的壮族患者400例，对照组为年龄匹配的正常壮族成年人400名。试验获得广西医科大学附属第一医院的伦理委员会批准。所有受试者均自愿入组，并签署知情同意书。根据MRI影像学特征，将病例组分为腰椎间盘突出、腰椎滑脱、腰椎管狭窄3个亚组。提取受试者基因组DNA，运用TaqMan探针技术对8q24.21区域rs7816342、rs4130415位点进行PCR荧光分型；并比较各组的等位基因频率、基因型频率分布差异。
结果与结论：①rs7816342、rs4130415位点的等位基因频率和基因型频率在病例组和对照组间差异无显著性意义(基因型：rs7816342；P=0.370，rs4130415，P=0.668)，但上述2个位点的基因型频率，在腰椎管狭窄组和对照组间差异有显著性意义(基因型：rs7816342，P=0.008；rs4130415，P=0.006)；②结果提示8q24.21区域rs7816342、rs4130415位点基因多态性与腰椎管狭窄存在显著相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID:0000-0002-3842-2247(刘洋)

关键词: 8q24.21区域, 腰椎退行性疾病, 单核苷酸多态性, 等位基因, 基因型, 全基因组关联分析, 广西壮族自治区；壮族

Abstract:

BACKGROUND: A genome-wide association analysis performed on North European shows that single nucleotide polymorphism (8q24.21) is related to lumbar disc herniation, but the result in the other populations has not been confirmed.
OBJECTIVE: To investigate the association between single nucleotide polymorphism (8q24.21) and lumbar degenerative disease in Guangxi Zhuang population.
METHODS: Four hundred Zhuang populations with lumbar degenerative disease from January 2015 to December 2016 were selected as case group, and 400 healthy Zhuang adults as control group. The study was approved by the Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University. All participants were voluntary to the study and signed the informed consents. The case group was assigned into three subgroups based on MRI performance: lumbar disc herniation, lumbar spondylolisthesis, and lumbar spinal stenosis. The genomic DNA was extracted, and rs7816342 and rs4130415 (8q24.21) typing was detected by TaqMan prob. The distribution difference of allele frequency and genotype frequency was compared.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The allele frequency and genotype frequency of rs7816342 and rs4130415 (8q24.21) showed no significant difference between two groups (rs7816342, P=0.370; rs4130415, P=0.668). The genotype frequency of rs7816342 and rs4130415 was significantly different between lumbar spinal stenosis and control groups (rs7816342, P=0.008; rs4130415, P=0.006). (2) In summary, rs7816342 and rs4130415 polymorphism (8q24.21) is associated with lumbar spinal stenosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: 8q24.21 area, lumbar degenerative diseases, single nucleotide polymorphism, allele, genotype, genome-wide association analysis, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Zhuang

中图分类号:

R446

刘洋, 杨庆华, 关业文, 王嘉琦, 江华. 广西壮族人群8q24.21区域单核苷酸多态性与腰椎退行性疾病的相关性：800例资料分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 2980-2985.

Liu Yang, Yang Qinghua, Guan Yewen, Wang Jiaqi, Jiang Hua. Association between single nucleotide polymorphism (8q24.21) and lumbar degeneration disease in 800 cases from Guangxi Zhuang Autonomous Region [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 2980-2985.

图/表（结果） 3

2.1 受试者数量分析病例组及对照组全部受试者都进入结果分析。两组研究对象性别差异无显著性意义(P > 0.05)，两组研究对象年龄差异有显著性意义(P < 0.05)。见表3。两组受试者分组流程图见图2。

2.2 8q24.21区域rs7816342、rs4130415位点的检测结果 ABI7500型实时荧光定量PCR系统测得的SNP结果显示，rs7816342位点的基因型有3种，分别是AA、AG、GG；rs4130415位点的基因型有3种，分别是TT、TC、CC。

2.3 Hardy-Weinberg平衡定律检测经χ²检验，病例组和对照组的研究对象在该群体均存在Hardy-Weinberg平衡(P > 0.05)。

2.4 8q24.21区域rs7816342、rs4130415位点与腰椎退行性疾病的相关性关系

2.4.1 rs7816342位点在病例组及对照组中的各等位基因、基因型频率见表4，A和G等位基因频率在病例组分别为75.0%和25.0%，在对照组分别占75.0%和25.0%，2组间等位基因频率分布差异无显著性意义(χ²=0.00，P=0.999，OR=1.000，95%CI：0.787-1.271)，2组间的基因型频率分布差异无显著性意义(χ²=1.986，P=0.370)。

在亚组分析中，腰椎间盘突出组(亚组1)的A和G等位基因频率在腰椎退行性疾病中分别为75.7%、24.3%，在对照组中分别占75.0%、25.0%，2组间等位基因频率分布差异无显著性意义(χ²=0.085，P=0.771，OR=0.961，95%CI=0.737-1.254)，2组间的基因型频率分布差异无显著性意义(χ²=0.426，P=0.808)。

腰椎滑脱组(亚组2)组的A和G等位基因频率在腰椎退行性疾病中分别为80.2%、19.8%，在对照组中分别占75.0%、25.0%，2组间等位基因频率分布差异无显著性意义(χ²=1.145，P=0.285，OR=0.739，95%CI=0.424- 1.288)，2组间的基因型频率分布差异无显著性意义(χ²= 1.182，P=0.554)。

腰椎管狭窄组(亚组3)和对照组的A和G等位基因频率在腰椎退行性疾病中分别为：47.6%、52.4%，在对照组中分别占75.0%、25.0%，2组间等位基因分布差异无显著性意义(χ²=2.702，P=0.100，OR=1.438，95%CI= 0.931-2.222)，2 组间的基因型频率分布差异有显著性意义(χ²=9.515，P=0.008)。

2.4.2 rs4130415位点在病例组及对照组中的各等位基因、基因型频率见表5，T和C等位基因频率在病例组中分别为78.6%、21.4%，在对照组中分别占77.6%、22.3%，2组间等位基因频率分布差异无显著性意义(χ²=0.235，P=0.628，OR=0.941，95%CI=0.782-1.207)，2组间的基因型频率分布差异无显著性意义(χ²=0.807，P=0.668)。

在亚组分析中，腰椎间盘突出组(亚组1)的T和C等位基因频率在腰椎退行性疾病中分别为79.5%、20.5%，在对照组中分别占77.6%、22.3%，2组间等位基因频率分布差异无显著性意义(χ²=0.615，P=0.433，OR=0.895，95%CI=0.677-1.182)，2组间的基因型频率分布差异无显著性意义(χ²=0.784，P=0.676)。

腰椎滑脱组(亚组2)及T和C等位基因频率在腰椎退行性疾病中分别为83.7%、16.3%，在对照组中分别占77.6%、22.3%，2组间等位基因频率分布差异无显著性意义(χ²= 1.692，P=0.193 OR=0.674，95%CI=0.371-1.255)，2组间的基因型频率分布差异无显著性意义(χ²=1.736，P=0.420)。

疾病中分别为70.6%、29.4%，在对照组中分别占77.6%、22.3%，2组间等位基因频率分布差异无显著性意义(χ²=2.506，P=0.113，OR=1.130，95%CI=0.627- 2.095)，2组间的基因型频率分布差异有显著性意义(χ²= 10.343，P=0.006)。

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引言

材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计病例-对照。

1.2 时间及地点试验于2015年1月至2016年12月在广西医科大学第一附属医院完成。

1.3 对象选取病例组为2015年1月至2016年12月在广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科门诊或病房就诊的腰椎退行性疾病患者400例，其中男188例、女212例，年龄16-84岁，平均年龄(49.87±14.86)岁。根据MRI的影像学特征病例组进一步分为3个亚组(见图1)：腰椎间盘突出(286例)，腰椎滑脱(58例)，腰椎管狭窄(56例)。对照组均来自广西医科大学第一附属医院体检中心，共400名，男208名、女192名，年龄20-62岁，平均年龄(55.05±13.42)岁。试验获得广西医科大学附属第一医院的伦理委员会批准，所有对象均自愿入组，并签署知情同意书。病例组和对照组按年龄和区域分布进行配比，均为散发病例的广西壮族人群。

病例组纳入标准：①年龄为18岁以上；②有腰背痛病史，伴有或不伴有下肢放射痛，病程超过3个月，经积极保守治疗后症状无缓解，或反复发作，影响日常生活；③ 经MRI证实在T2上表现为髓核信号强度广泛且明显下降或髓核低信号合并椎间隙变窄(Pfirrmann分级法分组为Ⅲ至Ⅴ级)。

病例组排除标准：合并肝肾疾病、呼吸系统或内分泌疾病患者；合并自身免疫性疾病、肿瘤等；有精神疾病或行为障碍不能进行自我评价者。

对照组纳入标准：既往无腰背痛病史，无腰腿痛病史，无结缔组织病史。

对照组排除标准：肿瘤患者；有精神疾病或行为障碍不能进行自我评价者。

核磁共振成像是目前最常应用的评估椎间盘病理变化的手段，邻近节段退变的发生逐渐增多，临床表现并不明显，很多仅限于影像学改变^[12-13]，磁共振中椎间盘信号特征在一定程度上反映其退行性改变^[14]。Pfirrmann评分系统是目前应用最为广泛的腰椎间盘退变核磁共振成像评估方法^[15-16]。对照组患者MRI的分级为Ⅰ级和Ⅱ级，病例组患者MRI的分级为Ⅲ至Ⅴ级，各级具体例数见表1。

分级	病例组	对照组
Ⅰ	0	276
Ⅱ	0	124
Ⅲ	122	0
Ⅳ	176	0
Ⅴ	102	0

1.4 方法

1.4.1 外周血及基因组DNA提取腰椎退行性疾病与健康志愿者于无菌条件下用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集外周血2 mL。利用基因组DNA提取试剂盒提取腰椎退行性疾病患者及对照组DNA。2.5%琼脂糖电泳检测基因组DNA的完整性及纯度。-80 ℃储存待用。

1.4.2 引物及探针设计位点信息根据美国国立生命信息图书馆NCBI数据库和已发表的相关文献所提供，8q24.21区域位点rs7816342，rs4130415位点多态性上获取相关序列信息见表2。

表2 rs7816342位点和rs4130415位点序列

Table 2 Sequences of rs7816342 and rs4130415

位点	序列
rs7816342 rs4130415	CAT GCC CTC ACA GGA ACT AAA ATA T[A/G]AAG TTT TTT TCT TCC TTT CAT GGT TCA CTT TTC TGT AAA GTA AAG CAG TGA AAA[C/T]ATC GCC GAG CAG CAC CAG TTT GAG G

1.4.3 荧光定量PCR反应体系聚合酶链反应(PCR)体系为25 μL：包括0.625 μL TaqMan Master，12.5 μL Mix， 4.825 μL双氢无酶水，7 μL DNA。PCR条件：预热60 ℃30 s，预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 60 s，共40个循环，延伸60 ℃ 30 s，在ABI 7500型实时荧光定量PCR系统上运行。

1.5 主要观察指标分别检测病例组和对照组rs7816342，rs4130415的基因多态性PCR分型，并比较2组间的等位基因频率、基因型频率分布差异。

1.6 统计学分析数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析，对rs7816342和rs4130415位点的等位基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡均进行χ²检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

腰椎退行性疾病是指随着年龄的增长，髓核、纤维环及软骨终板等腰椎间盘组织出现老化退变^[17-18]，腰椎退行性变是脊柱退行性疾病发生的重要因素^[19]。腰椎退行性疾病变是腰椎退行性疾病的病理生理基础，可引起腰椎间盘源性疼痛、腰椎间盘突出、腰椎失稳、腰椎管狭窄等常见腰椎疾患。既往研究证实遗传因素在腰椎退行性疾病发病机制中发挥重要作用，蛋白聚糖^[20]，Ⅰ型^[21]、Ⅸ型^[22-23]、Ⅺ型胶原^[24]，纤连蛋白^[25]，透明质酸与蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronic acid and proteoglycan link protein，HAPLN)^[26]，软骨间层蛋白(cartilage intermediate layer protein，CILP)^[27]，基质金属蛋白酶1，2，3^[28-31]、帕金森-泛素蛋白连接酶(Parkinson protein 2 E3 ubiquitin protein ligase，PARK2)^[32]，白细胞介素^[33-34]，维生素D受体等基因多态性可能与腰椎退行性疾病易感性相关^[35-37]。遗憾的是，大部分易感基因在不同人群中的重复性并不好，甚至在不同研究中出现了截然不同的结果。

全基因组关联研究是应用人类基因组中数以百万计的SNP进行病例-对照关联分析，从而揭示复杂性疾病遗传易感性的一种新策略，其与传统的候选基因关联研究相比，具有较高的特异性和敏感性。尽管如此，全基因组关联研究的局限性就在于常导致假阳性结果的产生。因此，在不同种族人群中对全基因组关联研究结果进行大样本量的验证研究至关重要。基因组关联分析研究表明，在冰岛人群中，通过大样本数据发现了与腰椎间盘突出高度相关的37个位于8q24.21区域位点。此次研究取自这37个位点中相关性较高的rs7816342、rs4130415位点，用于探究广西壮族人群中在8q24.21区域单核苷酸多态性与腰椎退行性疾病是否存在相关性。研究提示在广西壮族人群中rs7816342、rs4130415单核苷酸多态性与与腰椎管狭窄易感性存在显著相关性，但与腰椎退行性疾病易感性无显著相关性。此次研究结果与Bjornsdottir等学者^[11]的研究结果存在一定差异，作者认为这种差异可能与不同人种的遗传学背景、病例组的纳入标准等因素相关。首先，纳入研究的种族不同，Bjornsdottir等学者^[11]的研究人群来自北欧，属于高加索人群，而此次研究的所有对象均为广西壮族，属亚洲人群，两者遗传学背景存在较大差异。其次，研究对象年龄分布不同，Bjornsdottir等学者^[11]的研究人群病例组平均年龄是(44.9±13.70)岁，此次研究中病例组的平均年龄是(49.87±14.86)岁，这可能会导致这种差异的存在。最后，研究人群的纳入标准不同，Bjornsdottir等学者^[11]的研究中对象为社区人群，此次研究纳入的患者来自医科大学附属医院的门诊和病房，腰椎退行性疾病的严重程度不同也可能导致研究结果的不同。

在众多的腰椎退行性疾病病因学假说中，椎间盘凋亡与分化的失衡一直是占据着重要地位^[38-40]。卷曲螺旋结构26(coiled-coil domain-containing 26，CCDC26)基因位于染色体8q24.21区域，SNP位点rs7816342，rs4130415位于CCDC26基因的内含子序列^[11]。研究表明，CCDC26通过诱导环磷腺苷反应原件的磷酸化来诱导细胞凋亡蛋白酶8的转录，可增强细胞的凋亡^[41]，其多个SNP位点与细胞的凋亡和分化功能密切相关。CCDC26基因与神经纤维或中胚层细胞的增殖，凋亡与分化有关^[42-48]。由此可见，CCDC26基因是调节细胞凋亡与分化的关键基因之一，故作者推测rs7816342，rs4130415位点多态性可能影响椎间盘细胞凋亡与分化，从而参与腰椎退行性疾病的发生与发展过程，但具体功能有待进一步研究。

此次研究的意义是首次在广西壮族人群中，检测8q24.21区域rs7816342，rs4130415位点单核苷酸多态性在腰椎退行性疾病患者和正常对照人群中的分布差异性及相应罹患疾病风险比，以期为腰椎退行性疾病的早期预防、早期诊断和期治疗提供理论依据。研究尚有一定的局限性：第一，研究纳入了800例样本，纳入研究的样本量还不够大，可能存在结果偏倚；第二，研究只在广西壮族人群中验证，仍需在其他独立人群中进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

广西壮族人群8q24.21区域单核苷酸多态性与腰椎退行性疾病的相关性：800例资料分析

Association between single nucleotide polymorphism (8q24.21) and lumbar degeneration disease in 800 cases from Guangxi Zhuang Autonomous Region

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